张伦

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qPCR系列:荧光定量之优化验证(下)
上期的荧光定量PCR,我们讲到了qPCR验证。这不是一个简单的话题,大部分的qPCR问题都集中于此,所以多写一篇!这一篇,我们着重提出解决问题的办法,所以在此就直接切入问题了,避免你们被我的文采吸引而忘记了技能。一般来说qPCR调试经常遇到的问题集中在以下几个...

上期的荧光定量PCR,我们讲到了qPCR验证。这不是一个简单的话题,大部分的qPCR问题都集中于此,所以多写一篇!

这一篇,我们着重提出解决问题的办法,所以在此就直接切入问题了,避免你们被我的文采吸引而忘记了技能。

一般来说qPCR调试经常遇到的问题集中在以下几个方面:


■ 出现非特异性扩增 

 引物浓度难以选择和引物二聚体的困扰

 退火温度把握不准

 二级结构影响扩增效率


非特异性扩增


出现非特异性扩增,一般想到引物设计是不是不太合适,但是在不急着更换引物的情况下,可以先试试以下办法(原理也附上):


非特异性扩增

•  提高退火温度——尽量让弱氢键无法维持

•  缩短退火、延伸时间——减少弱氢键的结合机会

•  降低引物浓度——降低多余引物和非目标区域的结合机会



与非特异性扩增相反的情况——扩增效率低,应对扩增效率低的措施也刚好相反:


扩增效率低

•  延长退火、延伸时间

•  改为三步PCR,降低退火温度

•  提高引物浓度



Ps:很多90后研究生都不愿意再去研究如何调试实验,希望试剂盒就能够完全解决问题(如果毕业后想去试剂公司做研发的另说),实际上试剂厂商也是这样思考的,希望傻瓜拿到都会用,所以试剂厂商在解决非特异性扩增的问题上花了不少功夫,包括引入弱H键吸收因子


要想轻松解决问题,傻瓜们还是要会看试剂公司的介绍,有没有吸收弱氢键的因子


引物浓度难以选择和引物二聚体的困扰


法门1:一般来说qPCR的试剂盒说明书是有推荐体系和推荐引物浓度的。

法门2:通过设置引物浓度梯度的方法进行调试。


下面盗用天根的图片来做个说明,下图是用三个引物浓度梯度(100nM、250nM、500nM)和四个模板浓度梯度(0.1ng、1ng、10ng、100ng)做出来的荧光定量结果,根据实验结果的Ct值作图如下:


blob.png

▲ 引物浓度选择


把每个引物浓度连成一条线如下:


blob.png

▲ 引物浓度选择


很明显,100nM、250nM的引物浓度线性关系比较好,500nM的引物浓度线性关系比较差。而100nM、250nM中,250nM的Ct值比较小,所以最佳引物浓度是250nM


一般来说严重的引物二聚体在熔解曲线可以看到。如果设计的引物避免不了引物二聚体怎么办?


法门3:减少引物用量,升高退火温度(不用解释)。


退火温度把握不准


退火温度的经验值是60℃。

如果把握不准,怎么筛选比较合适的退火温度呢?答案跟引物浓度的选择是一样的——梯度测试

拿个Bio-rad公司的图来说明问题,对某一个目的片段的扩增,设置八个温度梯度,每个做三个重复,得到的扩增曲线如下:

A

B

C

D

E

F

G

H

70.0

69.0

67.3

64.5

60.7

58.0

56.2

55.0


blob.png

▲ 退火温度选择


解读:

◥ 70℃、69℃——基本上引物都无法结合,所以没有扩增。

◥ 67.3℃——开始有少量扩增,Ct值比较大。

◥ 64.5℃——Ct值减小。


60.7℃、58.0℃、56.2℃、55.0℃这几个温度下Ct值基本上趋于稳定,只是最后的荧光值有区别。又该如何选择呢?


原则:Ct值靠前是第一原则,同样的Ct值选择较高的退火温度,以避免二聚体和非特异性扩增。55℃虽然有较高的荧光值,但是里面可能会有二聚体或者非特异性扩增。所以对比下来选择60.7℃。

二级结构影响扩增效率

再拿Bio-rad公司的图片来说明问题,同样是设计温度梯度来扩增一个含有二级结构的基因。


blob.png

▲ 二级结构出现

温度梯度(℃)

70.0

69.0

67.3

64.5

60.7

58.0

56.2

55.0

平均Ct

32

26

25

27

29

31


可以看出,随着温度梯度的下降,开始有产物出现并且Ct值往前靠,在60.7℃达到最小值,之后随着温度梯度下降,Ct值变大。反过来说,随着温度提高,二级结构打开,扩增效率上升,当到达一定温度后,再升高温度也无法提高扩增效率。因为这个时候引物都无法稳定结合了。所以对比下来选择60.7℃。


所以,寻找Ct值最低的温度,这个温度就是扩增二级结构模板的最佳温度! 当然聪明的傻瓜们一定知道,非必须的情况下,最好更换引物,避开二级结构区域。


荧光定量PCR 试验优化
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qPCR系列:荧光定量之优化验证(上)
上一篇关于荧光定量PCR试剂盒的文章,似乎引起了强烈的反响,反响之一是配图风景太美,绝对是生物技术文章中写景最好的文章,或者说是写景文章中最讲技术的文章。所以,无论是一件什么事情,我们都要认真的对待,即便是文章中的一个小插图!做荧光定量也是一样,我们需把每一步...

上一篇关于荧光定量PCR试剂盒的文章,似乎引起了强烈的反响,反响之一是配图风景太美,绝对是生物技术文章中写景最好的文章,或者说是写景文章中最讲技术的文章。

所以,无论是一件什么事情,我们都要认真的对待,即便是文章中的一个小插图!做荧光定量也是一样,我们需把每一步验证都做到思路严密,无可挑剔,那么论文自然是完美。

本篇文章是qPCR的重中之重多少英雄好汉都在这里折戟沉沙,当然也有可能你运气比较好,研究的基因也简单,所以顺着风飘过了冰窟窿。

qPCR的验证信息意在检验数据的可靠性,我们把必要的验证信息罗列如下:

qPCR VALIDATION


Evidence of optimisation   (from gradients)  优化渐变过程

D

Specificity (gel,   sequence,  melt, or digest) 

检测特异性(凝胶电泳,测序,溶解曲线,酶切)

E

For SYBR Green I, Cq of the   NTC(空白对照的Ct值)

E

Standard curves with slope   and y-intercept 标准曲线

E

     PCR efficiency calculated from slope 从斜率计算PCR效率

E

     Confidence interval for PCR efficiency   or standard error

D

     r² of standard curve(标准曲线的相关系数)

E

Linear dynamic range(线性动态范围)

E

     Cq variation at lower limitCt值变化)

E

     Confidence intervals throughout range

D

Evidence for limit of   detection (检测的精度)

E

If multiplex, efficiency   and LOD of each assay(多重qPCR检测下每一个的效率和LOD

E


E:essential information基本信息(必须提交);

D:desirable information理想的信息(尽可能提供)


 1、特异性检验

通过检测电泳图片是否是单一条带;测序验证;熔解曲线看峰图是否单一;酶切验证等方法,检验目的基因扩增的特异性。


在此,我们着重介绍用熔解曲线的方法分析非特异性扩增的问题,一般来说由于我们引物设计的时候要求产物片段大小在80-200bp这个范围,这使得PCR产物的熔解温度在80-85℃的范围。

所以如果有杂峰的情况肯定是有其他非特异性扩增产物出现;如果波峰出现在80℃以下,一般考虑是引物二聚体;如果波峰出现在85℃以上,一般考虑是有DNA污染或者更大片段的非特异性扩增。

 注意!有时候只有一个80℃的单峰,这时候一定要坚持这个理念,很可能该扩增结果全部是引物二聚体。


blob.png

▲ 正常的熔解曲线(单一峰无非特异性扩增)

blob.png

▲ 有问题的熔解曲线(杂峰有非特异性扩增)


【案例分析

A. 有主峰,但是引物二聚体严重

blob.png

▲ 有主峰,但是引物二聚体严重



B. 无目标片段,全是引物二聚体。


这个单峰的溶解曲线很容易欺骗你的眼睛,认为是很完美的实验,结果完全错了,这时候我们得看溶解温度,波峰温度在80℃以下,完全是引物二聚体。


blob.png

▲ 全是引物二聚体


在此,哥哥有点欲罢不能了,下图是一个客户发给我的用手机拍的照片,客户使用的试剂都是业界常用的品牌,从一个T字头品牌更换为另外一个T字头品牌,我想你们已经猜出来了。客户向我哭诉:“第一个图片使用的试剂太好了,波峰单一,后来使用你推荐的试剂以后,变成第二个图的样子,出现了杂峰。你把我坑惨了。” (该哭的是我好么)

  事实上,我们很容易被这种图片麻痹,仔细分析后发现:第一个图波峰处于75℃,完全是引物二聚体;第二个图波峰分别出现在75℃和82℃,至少还有产物出现。

blob.png

▲ 客户反馈图片

所以根本的问题不是试剂问题,而是引物设计的问题,同时也证实了某些大牌并不是铁打的质量,也应证了哥哥之前说的那句话:不是试剂品牌撑起了你的文章,而是你的文章撑起了试剂品牌。试想,如果这个不太懂的客户没有更换试剂,这个错误的数据就这样拿到杂志社等着悲剧。



 2、空白对照的Ct值

不解释,如果空白对照有Ct值,不就是污染了吗?


 3、标准曲线

包括斜率和计算公式,通过公式可以计算PCR效率,一个完美的实验,要求标准曲线的斜率slope趋近于3.32,R² 趋近于0.9999。

QQ图片20180615164221.png

举个栗子:我们按照下表的浓度梯度得出标准曲线和扩增效率。


浓度梯度

1.55×102

1.55×103

1.55×104

1.55×105

1.55×106

Ct

14.89

 

17.92

 

21.18

 

24.56

 

27.89

66b4459r92P1ABfxBLSlTVVMl402V6T5I8CxbYcTshlxSUEicBNkkWaSkQdau16lib3FXOcyFY0hJX6f2k6GI5OA


blob.png

▲ 标准曲线(该图非上表数据)




 4、线性动态范围

反应的动态范围是线性的,根据生成标准曲线的模板,动态范围应当包括至少3个数量级的梯度,理想状态5个浓度梯度,并且注意高浓度梯度和低浓度梯度下Ct值的变化。



 5、检测精度


检测精度。qPCR结果变化,也就是重复性不好,也即精度差的问题,是由很多因素导致的,包括温度、浓度、操作等都会影响。qPCR精度的一般随着拷贝数减少而变得更不可控。理想的状态是实验内变化,这种技术上的变化应该有别于生物变异,生物复制可直接解决不同组或治疗组之间的qPCR结果的统计学差异。特别是诊断分析,必须报道不同部位和不同操作者之最批间精度(重复性)

6、如果是多重qPCR,每一个检测的效率和LODLOD为检测到阳性样本最低浓度为95%。换句话说,包含一组靶基因复制内LOD的浓度最多不超过5%失败反应。在做多重qPCR分析时,特别是就应用于同时检测点突变或多态性检测,多重qPCR需要提供证据表明多个目标片段的准确度在同一管中不受损,多重检测和单管检测的效率和LOD应该是相同的。特别是高浓度靶基因和低浓度靶基因同时扩增时,必须注意这个问题。


对于科研用户,我们还有一些比较实际的问题需要探讨,限于篇幅,下一篇再讨论。对了,如果有不对的地方,欢迎大家留言指正,不得不说,对于假学霸来说,对技术还是很饥渴的。

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荧光定量PCR
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qPCR系列:荧光定量PCR之程序设计
不知不觉已经到了寒风凛冽的冬季,北方已经飘过了第一轮雪花,东北朋友的朋友圈已经开始秀起冰雕冰灯等等这个季节独有的风景。不好意思,小编所在的城市只能算是算是秋风瑟瑟,金黄色的银杏叶片铺满地,风景美不胜收。然而这也是一个做实验的季节,冷了正好躲在实验室,每天进出实...

不知不觉已经到了寒风凛冽的冬季,北方已经飘过了第一轮雪花,东北朋友的朋友圈已经开始秀起冰雕冰灯等等这个季节独有的风景。

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不好意思,小编所在的城市只能算是算是秋风瑟瑟,金黄色的银杏叶片铺满地,风景美不胜收。

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然而这也是一个做实验的季节,冷了正好躲在实验室,每天进出实验室是不是有种升温退火的感觉 ,秒变PCR反应。

关于荧光定量PCR过程,在MIQE中有如下要求:

qPCR PROTOCOL


Complete reaction   conditions 完整的反应条件

E

     Reaction volume and amount of cDNA/DNA 反应体积和模板量

E

     Primer, (probe), Mg++ and dNTP   concentrations

     引物,镁离子,dNTP浓度

E

     Polymerase identity and concentration 酶的信息、浓度

E

     Buffer/kit identity and manufacturer 试剂盒制造商

E

     Exact chemical constitution of the   buffer 缓冲液组成

D

     Additives (SYBR Green I, DMSO, etc.) 染料

E

Manufacturer of   plates/tubes and catalog number

管子板子的制造商和货号

D

Complete thermocycling   parameters 完整的热循环参数  

E

Reaction setup   (manual/robotic) 反应设置

D

Manufacturer of qPCR   instrument 仪器制造商

E


E:essential information基本信息(必须提交);

D:desirable information理想的信息(尽可能提供)



 1、qPCR试剂盒


按照MIQE要求,我们必须在文章中清楚的描述完整的反应条件,包括PCR的反应体系配置,用的什么试剂盒,制造商是谁,多大的反应体系,用的是染料法还是探针法。事情并非仅仅描述那么简单,这就牵涉到大家要如何选择荧光定量试剂盒。

目前,荧光定量PCR试剂盒的制造生产已经是一个非常成熟的技术,只要不是选择极偏极烂的厂商,试剂有问题基本上是一个中500万一样的概率,不过我们还是要跟大家普及几点:



热启动Taq酶

PCR最重要的部分是热启动Taq酶,市面上的热启动酶一般分为两种类型,一种是化学修饰的热启动酶(你可以想象成石蜡包埋),一种是抗体修饰的热启动酶(抗原抗体结合)。化学修饰是早期的热启动酶存在方式,达到一定的温度,酶就释放活性。抗体修饰的热启动酶是用生物学的办法封闭酶的活性,当到达一定温度,抗体作为蛋白就变性失活,酶的活性就发挥出来了。

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然而,这个有什么用呢?是这样,抗体修饰的酶释放活性比化学修饰的酶释放活性要快,所以在灵敏度方面,抗体修饰的酶略占优势,以至于市面上的试剂盒基本上已经没有化学修饰的酶了。如果有,那么这个厂家还技术还停留在千禧年的时代。不过也有人有不同意见,看各家怎么吹。


镁离子浓度

镁离子浓度在PCR反应中至关重要,合适的镁离子浓度能够促进Taq酶活性释放,浓度过低,会显著降低酶活性;浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。镁离子浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度,从而影响扩增片段的产率。

镁离子离子的浓度一般控制在25mM,当然了,一个好的试剂盒,镁离子浓度一定是控制的比较好的。有的商家在试剂里面加入镁离子的螯合剂,可以达到镁离子浓度自动调节的作用。



荧光染料浓度

荧光染料,也就是我们通常用的SYBR Green,该染料主要是靠结合在双联DNA的小沟中发生荧光,由于该染料对双链DNA的结合是非特异性的,也就是说只要是双链DNA与其结合,都能发生荧光,所以体系中的引物二聚体、DNA模板等都会与其结合,形成本底信号。由于其光敏的特性,市面上的产品一般都用棕色离心管包装(如下图)。

blob.pngblob.png


荧光染料的浓度也很重要,浓度过低导扩增曲线后期上不去,不完美;浓度过高会造成噪点干扰。由于荧光定量PCR主要是看CT值,所以如果调不好荧光染料的浓度,低点比高点好。当然合适的染料浓度是最好的。

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ROX

ROX染料是用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。某些仪器厂家需要校正,某些不需要。例如使用Thermo Fisher Scientific公司的Real Time PCR扩增仪通常就需要校正,包括7300、7500、7500Fast、StepOnePlus等。一般试剂盒说明书都会有所描述。



弱氢键处理

弱氢键的处理是一个比较有技术含量的事情,小编翻看了很多试剂盒的说明书,都没有提到过这个话题,其实它是那么的重要。碱基的结合主要靠氢键的力量,强氢键就是正常扩增,弱氢键导致非特异性扩增,如果不能很好的消除弱氢键,非特异性扩增就无法避免。


在笔者目及范围内,只有少数几家公司注意到这个问题,比如说天根。各位在购买试剂盒的时候可以对照参考你要选择试剂盒是否在这方面考虑过解决方案。


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反应体积



20-50ul体系是比较常用的,更小的体积容易造成误差一般来说,试剂盒的说明书会有推荐使用PCR反应体积,大家切勿自作聪明,用更小的体积以达到节省成本的目的。商家推荐使用体积,其实是经过测试的,也可能就是他们无法解决小体积造成误差这个问题。



 2、管子板子的制造商和货号


荧光定量PCR的原理大家都知道,荧光收集主要是通过PCR管盖进行的,选择PCR耗材注意两点:透光性好,适配仪器。一般来说主流品牌的板子和管子都没问题,但是在适配方面得谨慎选择,要不然会上不了仪器。


blob.pngblob.png




 3、完整的热循环参数


(不解释,哪个PCR不要呢?)



 4、仪器制造商


(不解释,就那么几个品牌。)


没有想到一个试剂盒那么多学问吧~ 现在科研狗狗们的感觉是一脸懵逼,还是了然于心? 欢迎在下方留言告诉我们噢~

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荧光定量PCR 程序
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qPCR系列:荧光定量PCR之基因信息
不知不觉,我们逝去的秋天如沐春风,遇见的冬天热情澎湃~ 荧光定量PCR系列我已经讲到了中场,各位学渣们都还在吧,千万别去东北玩儿泥巴啊,就算不学习,追求小师妹也行。学霸们肯定天天盯着这个号,心里OS: 看你要写啥? 随时准备着挑刺儿~这个挑...

不知不觉,我们逝去的秋天如沐春风,遇见的冬天热情澎湃~ 


荧光定量PCR系列我已经讲到了中场,各位学渣们都还在吧,千万别去东北玩儿泥巴啊,就算不学习,追求小师妹也行。学霸们肯定天天盯着这个号,心里OS: 看你要写啥? 随时准备着挑刺儿~

这个挑战我接受!有问题稿费算你的。

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我们要讲的MIQE清单已经到了第五条。话说MIQE清单你还记得几式?你不会像张无忌那样一式也不记得了吧? 

温故而知新,一共九条,列举如下(对待学渣要随时回味):


– Experimental Design (实验设计)

– Sample Information (样本信息 )

– Nucleic Acid Extraction (核酸提取)

– Reverse Transcription (反转录)

– qPCR Target Information(目的基因信息)

– qPCR Oligonucleotides(qPCR 寡核苷酸)

– qPCR Protocol (qPCR 程序)

– qPCR Validation (qPCR验证)

– Data Analysis (数据分析)



目的基因信息


今天要说的是第五条 —— 目的基因信息

(别慌,先上图后解释~)


qPCR TARGET INFORMATION


If multiplex, efficiency and LOD of each assay.每次检测是否可重复,有效

E

Sequence accession number 登录号  

E

Location of amplicon    位置

D

     Amplicon   length  长度

E

     In silico specificity screen (BLAST,   etc)

E

       Pseudogenes, retropseudogenes or other homologs?

假基因,逆转录假基因,或者其他同系物

D

       Sequence   alignment  序列比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov

D

     Secondary   structure analysis of amplicon 二级结构分析

D

Location of each primer by exon or intron (if   applicable)

 引物相对于外显子和内含子的位置

E

     What   splice variants are targeted?  构象预测  

E

E:essential information基本信息(必须提交);

D:desirable information理想的信息(尽可能提供)。



上图解释


1. 这个基因对于重复实验是否有效

一般通过重复实验可以得到验证


2. 基因ID

学渣也该懂的点~ 不多说


3. 基因长度

目的基因总长度肯定没有问题的,在设计引物的时候,还要确保扩增子的长度在80-200bp之间,以保证有比较好的扩增效率。


4. 序列Blast比对信息

目的基因需要在genebank做比对,以防止非特异性扩增的出现



5. 是否存在假基因

假基因(pseudogene)与正常基因相似,但丧失正常功能的DNA序列,往往存在于真核生物的多基因家族中,常用ψ表示,是基因组中与编码基因序列非常相似的非功能性基因组 DNA 拷贝,一般情况都不被转录,且没有明确生理意义。



6. 引物相对于外显子和内含子的位置

早年,我们在解决DNA污染问题的时候,常常会关注引物和外显子、内含子的位置,一般考虑跨内含子设计引物,避免将DNA扩增出来。


请看下图:黑色代表内含子,各种蓝色代表外显子,粉红代表普通引物,鲜红代表跨内含子引物。


blob.png

这看起来是多么完美的计划~

而实际上,跨内含子引物在多数情况下没有想象中那么大的魔力,同样会引起非特异性扩增。所以为了防止DNA污染的最佳方法还是彻底去除DNA。



7. 构象预测

再次使用这个例子,用 mFold 在线工具,判断在特定温度和盐浓度条件下,目标片段的二级结构。

QQ图片20180615170743.png


二级结构是模板本身自己互补配对 ,它会导致引物与模板配对面临很强烈的竞争,引物就机会少了,结果E很低、重复性很差,等等一系列的问题出现。
通过软件预测,如果没有二级结构的问题,那再好不过了,如果有,我们后续的文章会专门讨论如何解决这个问题。

学渣们都看懂了吗?


咱们下期再战!


荧光定量PCR
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qPCR系列:荧光定量PCR之反转录
同一时间,同一梦想,欢迎大家收听阅读本期文章,为圆满完成荧光定量PCR实验,为缔造科研事业的精彩未来,我们齐聚“基因帮科研服务”平台,共同探讨,共同进步,共同渡过这美好的黄昏时分~咳咳,收!那啥,接下来敲黑板了啊!上周咱们过了一下《荧光定量PCR之核酸提取》,...

同一时间,同一梦想,欢迎大家收听阅读本期文章,为圆满完成荧光定量PCR实验,为缔造科研事业的精彩未来,我们齐聚“基因帮科研服务”平台,共同探讨,共同进步,共同渡过这美好的黄昏时分~

咳咳,收!

那啥,接下来敲黑板了啊!上周咱们过了一下《荧光定量PCR之核酸提取》,收到的阅读量不尽人意。哼!小样儿~ 我就知道,你们都不看好核酸提取,觉着那是最简单的事儿,等到吃了亏才知道感叹:“曾经有一篇《荧光定量PCR之核酸提取》摆在我面前,我没有点进去,直到实验失败才后悔莫及。 玩儿过多米诺骨牌的你,知道从头再来的赶脚吗!

其实你并不是不会提,是观念不对!

所以这期,我先划重点——观念!有了反转录的正确观念,你就可以不看后面的【大师兄和小师妹】系列了。ps:我知道现在你想看下去了。


反转录的错误观念:追求较高的上样量 。

反转录的正确观念:追求一致性(稳定性),不管RNA上样量如何,反转录的效率都保持一致,确保cDNA的差异能够真实反映 mRNA 的差异。

这个教条具体如何呈现呢?


请看下图和解释:



blob.png




01 反转录与PCR过程的区别

首先,我们要理解反转录过程与PCR过程的区别,PCR经过多次升温退火延伸的过程,目的片段呈指数增长;而反转录没有这个过程,我们可以想象反转录其实就是一对一的复制过程,有多少条RNA就得到多少条cDNA。

所以也告诉大家,反转录的结果拿去做电泳检测,基本上就是弥散的,如瀑布般,看不到任何有用信息,因为大大小小的片段都被反转录了,无法集中在一个片段上。由于RNA的量比较少,所获得的cDNA量也比较少,因此,基本上无法进行检测。


02 反转录稳定性

其次,解释上图。理想情况下,反转录一对一进行,但是没有哪个公司的反转录酶能够达到这种效果,基本上大多数反转录酶的效率游走在30-50%之间。如果现实情况是这样的话,我们宁愿反转录效率能够比较稳定,也就是图中我们希望看到的部分:3条RNA得到2条cDNA,6条RNA得到4条cDNA,这样无论上样量多少,反转录效率都比较稳定。我们不希望看到反转录效率不稳定,高浓度被抑制的情况。


那么,如何验证反转录效率是否稳定呢?方法很简单,只需要做个对比试验:一是RNA进行倍比稀释后再反转录成cDNA,二是反转录成cDNA后再做倍比稀释两者做qPCR,看看得到的斜率是否一致。作为学霸的你应该秒懂。如下图:

blob.png



反转录酶和试剂盒

完美的荧光定量PCR怎么少得了优秀的反转录酶以及试剂盒呢。所以,学霸们!再次敲黑板了!


QQ图片20180615171735.png

反转录酶根据来源大体上分两种AMV或者M-MLV,他们的性能跟表格中显示的是一样一样的。

01 RNase H 活性

首先说RNase H活性。

RNase H即Ribonuclease H,中文名为核糖核酸酶H,是一种核糖核酸内切酶,可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。RNase H不能水解单链或双链DNA或RNA中的磷酸二酯键,即不能消化单链或双链DNA或RNA。常用于cDNA第二链的合成。


这是一个奇怪的东西。我们说反转录酶有RNase H活性,并不是说反转录酶中含有RNase H,也无法从反转录酶中分离出RNase H,也许是反转录酶中某些基团的构象造成了该反转录酶有此活性存在。


所以,别看AMV反转录效率高一些,但是其RNase H活性使得cDNA的得率降低。当然,试剂厂商都在不断优化自己的产品,尽量消除反转录酶中的RNase H活性,提高cDNA的得率。


02  退火温度

  

QQ图片20180615170743.png       


其次我们看看反应温度。

看上图,用mFold在线工具,判断在特定温度和盐浓度条件下目标片段的二级结构。该RNA在55℃的情况下,二级结构还是非常复杂的,反转录酶无法工作,要到65℃才能完全解开二级结构,而AMV和M-MLV的最适温度都远远小于这个温度。

怎么办?

二级结构是模板本身自己互补配对,导致引物和反转录酶与模板结合面临很强烈的竞争,导致结果E很低、重复性很差,等等一系列的问题。

怎么办?

只有尽可能提高退火温度

很多试剂厂家都在改良自己的反转录酶,在笔者接触的产品中,TIANGEN的Quant系列反转录酶给出的解决方案是:通过基因克隆重组的方法,首先去除RNase H酶活性基团,其次是提高酶和RNA模板的亲和力。高亲和力可以竞争性地挤开二级结构,顺利的通读下去,同时也大大地提高了反转录效率。(保证没有收一分钱的广告费

啥?其他公司有没有别的解决方案?笔者不知,他们也没有告诉过我,活该广告不到。


划重点


反转录更重要的是在追求反转录效率的一致性酶不仅要效率高还要稳定),而不是上样量,如果不是做特别大规模的荧光定量PCR,根本要不了那么多的cDNA。

各厂家在追求一致性的方面也做了些功夫,比如现在大部分公司都已经把反转录包装成为标准的试剂盒进行销售,这不失为一种很好的选择。

不说了,笔者要赶紧去给基因帮打电话了!

逆转录 反转录 荧光定量 cDNA第一链合成
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qPCR系列:荧光定量PCR之核酸提取
不得不说,大师兄写之前几篇文章真是做到了心如猛虎细嗅蔷薇,耗费了大量的元气,所以不服的也别来战,我怕你。不过这对学霸来说都是小case,渣渣们只要听话照做多练习,保证学霸名号指日可待也。生物学实验虽然难但是高端,一不小心可以颠覆世界,比如搞个SARS变成生化危...

不得不说,大师兄写之前几篇文章真是做到了心如猛虎细嗅蔷薇,耗费了大量的元气,所以不服的也别来战,我怕你。不过这对学霸来说都是小case,渣渣们只要听话照做多练习,保证学霸名号指日可待也。

生物学实验虽然难但是高端,一不小心可以颠覆世界,比如搞个SARS变成生化危机,比如搞个杂交水稻拯救13亿人口。下图就是个化学实验,你们看看他那个屌丝样子就应该明白自己的研究有多么骄傲。算了,别黑他。

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本篇重点如题目——核酸提取。

核酸提取是一个大事,所有的分子生物学实验都是从核酸提取开始。首先,我们还是照抄一下MIQE关于核酸提取的内容。

再次强调,在MIQE核查清单里,有D和E两个字母表示该项的重要性。


E:essential information基本信息(必须提交);

D:desirable information理想的信息(尽可能提供)。

NUCLEIC ACID EXTRACTION  核酸提取


Procedure and/or instrumentation  过程和/或仪器

E

     Name of   kit and details of any modifications  试剂盒名称以及变动细节

E

     Source of   additional reagents used  其他试剂的来源

D

Details of DNase or RNAse treatment   DNA酶或RNA酶处理的细节

E

Contamination assessment (DNA or RNA)   污染评估(DNARNA

E

Nucleic acid quantification 核酸定量分析

E

       Instrument and method  仪器和方法

E

     Purity   (A260/A280)  纯度(A260/A280

D

       Yield  产量

D

RNA integrity method/instrument   RNA的完整性的方法/工具

E

    RIN/RQI or   Cq of 3‘ and 5’ transcripts  RNA质量评估的数据

E

      Electrophoresis traces 电泳图片

D

 Inhibition   testing (Cq dilutions, spike or other)    抑制测试(高低浓度或其他情况下下CT值受不受抑制)

E


看这个表格不能停留在表面,表格就是教条,要做学霸一定要多问个为什么。

这个表格的本质内容是:追求RNA的纯度、完整性、一致性、提取量。


接下来就一一分析这个表格是如何通过条款来追求这些的。在涉及到荧光定量PCR的文章中,需要对以上表格里面的项目作详细描述。


1、过程或者仪器


第一个部分就是核酸提取的步骤,如果用核酸自动提取仪提取(高级哦),需要注明仪器的型号名称

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这台百泰克的核酸自动提取仪摆在这里,你看不清logo应该不算打广告。

试剂盒名称以及变动细节:用的什么试剂盒,加了什么特殊试剂或者做了什么特殊操作要讲明白,以便别人能够方便的重复出你的实验。

有的人在提取特殊样本的时候加了一些特殊试剂,认为这是自己的秘密武器不告诉别人,保密的同时,也失去了让你的文章大放光彩的机会。千万别耍小聪明,做科研要做到比乡下老张还老实,你想耍小聪明,文章就会让你出笨笨。

记住,你们在订购试剂盒以及写入文章的时候一定要记住试剂盒的产品编号,试剂盒上一般有两个编号:Cat——产品目录号(产品编号、货号),Lot——产品批号(用于标明产品出于哪个批次)。看不懂的看看下面这张偷来的图片就明白了。

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另外订购生物化学类试剂的时候经常会用到CAS号,我就一起普及了,CAS号是美国化学会专门负责给予每一个新出的化学药品的编号,一般是三个数字用短杠连接。如水的CAS号:7732-18-5。化学药品常常会有多个别名,但是CAS号是唯一的。订购药品的时候可以先查查它的CAS号。

言归正传,为什么要清楚明白的描述这些,其实也是为了在RNA提取质量上把关,仪器和试剂盒信息的加入,会让RNA提取一致性更好。


2、DNA酶或RNA酶处理的细节


荧光定量PCR很重要的问题是要防止DNA污染,有污染不实验。因此,必须要说明你用于处理DNA的过程,这是为了证明实验过程中的DNA保证已经得到完全彻底的去除。同样,如果是做DNA的定量,也要保证RNA被完全的去除。

 

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一般来说,去除DNA的方法是提取RNA后用DNase处理。不过这都是比较老的方法了,商品化的RNA提取试剂盒,已经能够在提取过程中去除DNA,比如TIANGEN生化的RNA提取试剂盒(不小心说漏了,但是我知道你想知道)。


 注意:

提取RNA的过程中去除DNA是非常危险的双刃剑,这会使得提取RNA的操作时间延长,增加RNA降解的风险,基本上就是在RNA得率和纯度之间做取舍。

另外,在硅基质吸附柱上加入的DNase量非常小,必须要优质的DNase才能达到效果,未经优化的DNase是无法做到快速彻底消化的,这一点非常考验商家技术水平。

当然,更有奇葩的商家吹嘘说不用DNase也能去除DNA,可以这么说,凡是吹牛说不用DNase就能彻底清除DNA的都是耍流氓。DNA是比较稳定的双链结构,不是吹吹风就灰飞烟灭的。


3、污染评估(DNA或RNA)


评估方法:电泳检测  1%琼脂糖,6V/cm,15min,上样1~3 ul    

QQ图片20180615172959.png



4、核酸定量分析


通常使用紫外分光光度计进行测量 ,先给大家普及一下OD260、OD280、OD230三个值的含义。

  • OD260nm:是核酸最高吸收峰的吸收波长,最佳测量值的范围为0.1至1.0。如果不在此范围,稀释或浓缩样品,使之在此范围内。

  •  OD280nm:是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长。

  • OD230nm:是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长。

接下来说各个指标的作用。对于A260来说,可以用来测定核酸的产量。当OD260=1时,dsDNA=50μg/ml,ssDNA=37μg/ml,RNA=40μg/ml。


对于纯度来说,就需要看那几个我们常见的比值了:OD260/280及OD260/230。

  • 纯DNA:OD260/280约等于1.8,大于1.9时提示有RNA污染,小于1.6时提示有蛋白质及酚类污染。

  • 纯RNA:1.7<OD260/280<2.0,小于1.7时提示有蛋白质及酚类污染,大于2.0时提示有异硫氰酸残留。

  • OD260/230:不伦是DNA还是RNA,参考值都为2.5,小于2.0时提示有糖类、盐类、有机物的污染。



5、RNA的完整性的方法/工具


RNA的完整性非常重要,一般需要做一个RNA变性胶实验,检验28S和18S RNA之间的亮度是不是二倍关系。当第三条带5S出现的时候,说明RNA已经开始降解了,无脊椎动物除外噢。

RNA质量评估的数据:除了以上检测,在RNA完整性方面,还有一些比较高级的仪器检测,比如Experion全自动电泳系统RQI完整性检测,可以检测出RNA是否隐形的被降解。

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之前在文章《关于荧光定量PCR的白痴问题》中已经说到,定量其实是目标基因和内参基因的比较,RNA的完整性是如何影响目标基因和内参基因之间的平衡,可以从下图简单的理解。降解会导致基因残缺,无论是内参基因的残缺还是目标基因的残缺,对数据都是有极大的影响。(又拿出这张老图片忽悠你们)

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6、抑制测试(高低浓度或其他情况下CT值受不受抑制)

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以该图为例,五条曲线的Ct值分别如下。曲线之间CT值分布不均,高低浓度下Ct值均有延迟,这就是PCR受抑制的情况。

DNA提取 RNA提取 核酸提取
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qPCR系列:荧光定量PCR之样本信息
各位学渣学霸,想必qPCR这个话题预热已经很久了,MIQE这个话题也吹了很久的风了,快风干成标本了。真正的学霸,肯定已经接受点拨,早就去查找相关的文献,了解个彻彻底底。但是作为学渣的你,还在这里徘徊。没有关系,我们就是要把正儿八经的知识做成风趣嘻哈的段子灌进你...

各位学渣学霸,想必qPCR这个话题预热已经很久了,MIQE这个话题也吹了很久的风了,快风干成标本了。


真正的学霸,肯定已经接受点拨,早就去查找相关的文献,了解个彻彻底底。但是作为学渣的你,还在这里徘徊。没有关系,我们就是要把正儿八经的知识做成风趣嘻哈的段子灌进你们木头一样的脑袋。


今天我们要讲的是MIQE之样本信息,也就是说,我们在发表关于qPCR的文章的时候,一定要讲明白样本信息,这是文章不可或缺的部分。同样,我们在处理样本的时候,也要同样规范自己的操作,以保证样本的有效性


在MIQE核查清单里,有DE两个字母表示该项的重要性,

E:essential information基本信息(必须提交)

D:desirable information理想的信息(尽可能提供)


下面这个表格就是核查清单里样本信息要求:

SAMPLE(样品)


Description(对样本材料的描述)

E

     Volume/mass of sample processed(处理样品的体积/质量)

D

    Microdissection or macrodissection(显微切割,切割是否带有其他组织)

E

Processing   procedure(处理过程,是否新鲜材料)

E

     If frozen - how and how quickly?(冷冻,时间)

E

     If fixed - with what, how quickly?(包埋,材料固定和处理的方式)

E

Sample   storage conditions and duration (especially for FFPE samples)

(样品的储存条件和时间,贮藏条件)

E

对样本的描述只是一个结果,而我们更应该注意的是整个实验过程中的取材



实验材料的选择


血液样本——选择新鲜血液,不得超过4小时。

细胞样本——选择处于生长旺盛的时期收集新鲜的细胞。

动物组织——选择新鲜、生长旺盛的组织。

植物组织——选择新鲜的幼嫩组织。

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学渣们一定注意到这几句话中都有一个关键词:新鲜,所以说小鲜肉并不是大妈才喜欢,实验室的师姐师妹都喜欢。因为他们不油腻。


实验材料的保存


 一般来说,我们不建议对样本进行保存,如果条件允许的话。但是不乏有很多朋友无法在采样后立刻进行实验,有的甚至需要背着液氮罐到野外采样。


对于这种苦逼朋友,我只能说你不了解试剂耗材,现在很多试剂耗材公司生产出可以常温保存RNA样本的试剂,可以选择使用。因为他们都没有给广告费,所以这里就不介绍哪些厂家的产品了,当然了,你有需要可以通过公众号直接联系小编。


常规的保存方法就是液氮保存,你可别问我方便携带的小液氮罐在哪里购买,虽然基因帮网上有,但是我不能说,还是广告费的问题。把样本带回实验室以后,保存在-80℃冰箱即可。

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最后,我要提醒学渣渣们,对于牵涉RNA的实验,六字原则必须遵守:低温无酶快速


低温这个概念容易理解;无酶,我们生活的世界到处都是RNase(要不然你早就被HIV搞死了),所以在做实验的时候如何避免RNase,是一种很重要的观念;快速,天下功夫无坚不破,唯快不破。


有的女孩子做实验很仔细,但是做几年也不如一个灌篮高手做得好,觉得上天不公平,怨天尤人,寻死觅活,其实她没有明白,就是因为她太仔细做事情很慢,反而没有保护好RNA,而灌篮高手手脚灵便,做实验的时候还想着三下五除二搞定了灌篮去,反而把实验做好了。

注意:慢了,RNase入侵的机会就更多了。怎么训练自己快速呢?没有办法,多练习。

今天关于样本信息的讲解就到这,对于不同的实验不同的样本,还是要多看文献,选择合适的方式进行处理。对于样本的取材和保存过程,MIQE都要求必须清楚明白的写在论文中,以方便审稿人审阅论文的可靠性,同时也方便后来的愣头青们重复你的实验。今天就到这,我们下期再见。


荧光定量PCR 样本处理
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qPCR系列:荧光定量PCR之实验设计
上一期学霸系列中,大师兄给大家讲了荧光定量PCR与MIQE,相信大家已经收藏学习了。从本期开始,大师兄就将MIQE中的核查内容一一为大家讲解,今天,我们的主题是荧光定量PCR之实验设计。科研是很严谨的事情。如果因为看见我们的微信号经常发各种段子,就认为我们很不...

上一期学霸系列中,大师兄给大家讲了荧光定量PCR与MIQE,相信大家已经收藏学习了。从本期开始,大师兄就将MIQE中的核查内容一一为大家讲解,今天,我们的主题是荧光定量PCR之实验设计


科研是很严谨的事情。


如果因为看见我们的微信号经常发各种段子,就认为我们很不务正业,那你真的就是学渣了。


即便是我们讲段子,也是有严谨的态度,无论是字数、图片、编辑,我们都有严格的要求。


很多学渣在读完研究生完成答辩,还不会独立设计一个实验,笔记本翻开,老师叫怎么做就怎么做。结果实验设计不严密,杂志编辑部说要补这个图那个图,就晕头转向的跟着做了。学渣都是这样炼成的!


言归正传,实验的首要原则,是要确定实验逻辑的严密性。最根本的是实验设计,而实验设计最重要的是如何设定目标样本、参考样本(对照)、重复数量,让实验数据具有参考性、可比性和说服力。


 目标样本是指经过某种处理后需要我们检测目的基因的样本。参考样本即没有做任何处理的样本,生物学上常常说的野生型。


实验的重复(Experimental Replicates)非常重要,具有说服力的重复数量一般要达到三个以上,要区分什么是生物性重复、什么是技术重复。


生物性重复(Biological Replicates):不同的材料(时间、植株、批次、反应板)做的同一验证实验。(同一本王镜岩的《生物化学》虐几个学渣)。

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我们以农药处理辣椒为例子,我们要对ABC三个植株进行农药喷洒,那么ABC三个植株就是三个生物性重复,它们就是不同的材料进行的同一验证实验。但是作为实验肯定是需要对照的,所以我们在操作的时候可以对A植株的其中一根枝条进行喷洒,形成A植株的实验组,对A植株的其他枝条不喷洒,形成对照组。对B和C也进行同样的处理。


技术重复(Technical Replicates):是为了避免操作上导致的误差而设计的重复实验,实际上就是同一材料所包括的复孔。(用王镜岩的《生物化学》虐几个学渣N次,然后取平均数)。处理和对照都要有目的基因和内参基因的重复设置(最少三个)。

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再拿农药处理辣椒作为例子,对于A植株实验组,我们分别对它的目的基因和内参基因做1、2、3三个PCR复孔,以待检测完以后取平均数,对于A植株的对照组也作同样处理。同样,对于B、C植株也作同样的处理。这就是技术性重复。


值得注意的是:进入统计的是生物性重复,而技术重复是检验实验过程中是否有任何随机现象使实验结果可信,也就是为了我们经常说的取它们的平均数避免误差。


阴性对照,又分为NTC与NRT。

NTC(No-Template Control),没有模板的对照,用来验证实验材料是否具有污染。一般以水作为模板,如果有荧光反应,说明实验室有核酸污染发生。

这些污染来自于:水不纯,不合格的试剂含有内源DNA,引物污染,实验室器材污染,气溶胶污染等等,需要使用RNase清除剂和RNase抑制剂。气溶胶污染是最不容易发现的,想象一下你的实验室就像雾霾,空气中悬浮着各种核酸。


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NRT (No-Reverse Transcriptase),没有反转录的对照,是未经反转录的RNA作为阴性对照,这是对gDNA残留的控制。

在做基因表达时,通过检测反转录后的cDNA量来检测RNA的量,那么如果在提纯RNA时有gDNA的残留,就会造成实验结果的误差,因为实际得到的结果是gDNA和cDNA的总体水平而不仅仅是cDNA的,需要在提取RNA的时候彻底去除gDNA。

有的学霸自作聪明,费尽心思的设计跨内含子引物来避免gDNA,我想说他可能是个假学霸,我们以后会讨论这个问题。


今天的实验设计就讲到这里,下一期大师兄将给大家讲解荧光定量PCR之样本信息。让我们一起学习,早日成为学霸!


荧光定量PCR 实验设计 qPCR
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『学霸勿进』荧光定量PCR与MIQE
在上一期荧光定量PCR的文章中大师兄提到MIQE(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments)——用于发表关于实时定量...

在上一期荧光定量PCR的文章中大师兄提到MIQE(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments)——用于发表关于实时定量PCR实验文章的最小信息。为了简化大家的理解,我们将重点内容简化。


MIQE原文大家可以在网上搜索到,其中最重要的是其规定了发表文章的时候需要提供的数据核查清单,为了让大家速成学霸,大师兄将重点都给你总结了。


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本期MIQE的信息虽然比较多,但都是为我们的实验提供精准的信息审稿人读到这些细节就可以判实验的质量;将来的读者也可以据此来重复实验或者改进实验。在今后的文章中,我们会逐一讲解MIQE核查清单中的内容,各个击破。祝大家早日成为学霸



荧光定量PCR MIQE 标准
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学霸必看!荧光定量PCR与RDML
前方预警!今天的话题很!枯!燥!不过如果是想要进阶学霸,肯定是很有学习欲望的,因为无论是学术还是技术,越专心越有趣。关于实时荧光定量PCR,我们必须了解这样一个现实,每年发表的成千上万的科研论文,其中利用到荧光定量PCR技术的不是小数目。那如果没有一个共同的标...

前方预警!今天的话题很!枯!燥!

不过如果是想要进阶学霸,肯定是很有学习欲望的,因为无论是学术还是技术,越专心越有趣。

关于实时荧光定量PCR,我们必须了解这样一个现实,每年发表的成千上万的科研论文,其中利用到荧光定量PCR技术的不是小数目。

那如果没有一个共同的标准来衡量荧光定量PCR实验,结果可能千差万别,对同样的物种同样的基因,用同样的处理方式,检测出来的结果也是千差万别,后来者也难以重复出同样的结果。

这是不是说荧光定量PCR就是一个骗子技术或者说是一个不靠谱的技术?并不是,就是因为荧光定量PCR比较敏感比较精确,导致一点错误的操作就会出现完全相反的结果。

失之毫厘谬以千里。文章作者可能会被审稿人反复折磨,同时,杂志审稿人也被不同的实验结果难以取舍。

所有的一切,都指向荧光定量PCR实验没有达成共识。

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为此,行业资深科学家开始制定标准,要求投稿人在文章中提供一些必要的实验和数据处理的细节(包括必要的数据)来满足这些标准

审稿人读到这些细节就可以判实验的质量;将来的读者也可以据此来重复试验或者改进实验。那么这样出来的实验结果就是充满了信息量、是高质量的,是可用的。

MIBBI(Minimum Information for Biological and Biomedical Investigations - http://www.mibbi.org) 应运而生。MIBBI是一个为实验提供标准的项目,发表在nature上,这个项目针对各类生物学试验,包括细胞生物学、Microarray、我们现在要讨论的qPCR等等,给每一类实验规定了在提交稿件时是都应该提供那些信息。


MIBBI项目中,与荧光定量PCR相关的文章有两篇,分别是:

  • RDML (Real-Time PCR Data Markup Language )——实时定量PCR数据的结构化语言和报告指南;

  • MIQE(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments)——用于发表关于实时定量PCR实验文章的最小信息。

今天,我讨论的重点是RDML,也就是术语规范。

凡事如果没有标准定义,就无法继续讨论,这也是为什么名词解释在考试中如此重要的原因。

荧光定量PCR实验用到的术语包括以下内容,QIAGEN公司已经为我们做了最佳的总结,以下全是干货,建议学霸收藏不定期食用

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基 线

基线是早期循环的噪点水平,通常在第3和第15循环之间测量,这是因为在此期间还检测不到扩增产物引起的荧光值增加。用于计算基线的循环数量是可以改变的,如果使用高模板量或者靶标基因的表达水平高则循环数量需要减少。

设置基线需要查看线性度扩增曲线的荧光数据。设置基线,使得扩增曲线的增长所开始的循环圈数大于基线循环最高圈数。对每个靶标序列都需要单独设置基线。早期循环检测到的平均荧光值需要从扩增产物中获得的荧光值中减去。各种Real-Time PCR软件的最新版本允许单个样品自动优化基线设置。

 

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本 底

本底是指反应中的非特异性荧光值。例如:低效率的荧光淬灭;或由于使用SYBR Green造成的大量双链DNA模板。信号的本底分量由Real-Time PCR软件算法数学除去。

报告基因信号 

报告基因信号是指在Real-Time PCR过程中由SYBR Green或荧光标记的序列特异性探针产生的荧光信号。

归一化报告信号(RN)

RN指的是报告染料荧光强度除以在每个循环中测量的被动参照染料的荧光强度。

被动参比染料 

在某些Real-Time PCR中,荧光染料ROX被用作荧光信号标准化内部参照。它可以逐孔校正因移液不准确、孔位置及荧光波动造成的变动。

阈 值

阈值调整到本底值之上并显著低于扩增曲线的平稳值。它必须处于扩增曲线的线性区域内,代表了PCR检出的对数线性范围。阈值应在对数扩增曲线视图中进行设置,以使PCR的对数线性期易于识别。如果Real-Time PCR中有多个目标基因,阈值必须为每个目标进行设定

循环阈值(CT)或交叉点(CP)

扩增曲线穿过阈值的循环(即,荧光检测值显著增加的点)。CT可以是一个分数,并且可以计算起始模板量。

ΔCT值

ΔCT值描述了靶标基因和相应的内参基因CT值的差值,例如看家基因,并用于标准化模板的使用量:

⇒ ΔCT = CT (靶标基因) – CT (内源性参比基因)


ΔΔCT值

ΔΔCT值描述了感兴趣样品(例如,刺激细胞)的平均ΔΔCT值与参考样本(例如,未刺激细胞)的平均ΔΔCT值之间的差值。参照样品也被称为校准样品,并且所有其它样品进行相对定量时都将被标准化到如此:

⇒ ΔΔCT = 平均ΔCT (感兴趣样品) – 平均ΔCT (参比样本)


内源性参比基因

内源性参比基因的表达水平在样品间不存在差异,例如看家基因。对比内参基因与靶标基因的CT值可以将靶标基因的表达水平归一化到输入的RNA或cDNA的量(见上面关于ΔCT值部分)。


内参基因对以下情况作出校正:可能的RNA降解或RNA样品中存在酶抑制剂的情况,以及RNA含量、逆转录效率、核酸回收和样品处理的变动。为了选出最优的参照基因(多个),我们对算法进行了改进,允许其选择依赖于实验设置最优参照。


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内参

在同一反应中被作为靶序列扩增的,并用不同的探针(即,进行双重PCR)检测的对照序列。内参经常被用来排除失败的扩增,例如没有检测到目标序列的情况。


标定样品

在相对定量中使用的参比样品(例如,源自细胞株或组织纯化的RNA),用以与所有其他样品进行比较,以确定某一基因的相对表达水平。标定样品可以是任何样品,但通常是一个对照品(例如,未处理的样品或来自实验零时的样品)。


阳性对照

使用已知量模板的对照反应。阳性对照通常用来检查引物集或引物探针集工作是否正常,以及反应是否正确设置。


无模板对照(NTC

包含除模板之外的所有扩增反应所必要组分的对照反应。这使得发现由于污染的试剂或外源DNA造成的污染成为可能,例如从以前的PCR中。


RT对照(NRT

RNA制备物可能含有残留的基因组DNA,如果检测不被设计为仅检测和扩增RNA序列,其可以在real-time RT-PCR中进行检测。DNA污染可以通过操作在其中没有加入逆转录酶的RT对照反应来进行检测。


标准品

已知浓度或拷贝数,用于构建标准曲线的样品。


标准曲线

要生成标准曲线,CT/不同标准稀释的交叉点对标准物质输入量的对数绘图。标准曲线通常是使用至少5种不同浓度的标准稀释倍比生成。

每个标准曲线,应检查其有效性,斜率值落在–3.3–3.8之间。标准是各浓度一式三份的理想测定值。标准曲线的斜率如果与这些值差异较大则应该舍弃。

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效率和斜率

标准曲线的斜率提供了对real-time PCR的效率指示。斜率–3.322表示该PCR具有数值为1的效率,或100%的效率,并且PCR产物的量在每个循环增加到两倍。效率小于–3.322(例如,–3.8)则表示PCR的效率<1。通常,大多数扩增反应因为实验的限制不能达到100%的效率。斜率大于–3.322(例如,

qPCR 荧光定量PCR
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无论学渣还是学霸,你都应该知道的试剂品牌(二)
上一期给大家介绍了一些生物试剂行业的国际大牌,今天继续给大家介绍一些试剂公司,以及他们的主营业务,特别是核心产品,以方便大家选择。声明,以下排名不分先后。简介:OMEGA是一个美国品牌,产品质量可靠,价格中等,这样的定位使得这个品牌更加扑朔迷离,到底是进口货还...

上一期给大家介绍了一些生物试剂行业的国际大牌,今天继续给大家介绍一些试剂公司,以及他们的主营业务,特别是核心产品,以方便大家选择。


声明,以下排名不分先后。


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简介:OMEGA是一个美国品牌,产品质量可靠,价格中等,这样的定位使得这个品牌更加扑朔迷离,到底是进口货还是国产货?其实进口和国产已经没有那么重要了,中国都已经成为世界工厂了,你还在纠结进口国产?OMEGA作为一个美国的公司能够专注于核算纯化这一领域难能可贵,再加上近几年货币的贬值,使得OMEGA产品看起来走上了比较亲民的路线,不得不说是一个不错的选择。


核心产品:核酸纯化系列。


点评:核酸纯化领域的竞争可谓是白热化,上有QIAGEN,中间有TIANGEN,往下还有一大批国内小品牌涉足。大浪淘沙见真金。OMEGA一直想拓展产品线,但是核酸纯化系列已经给客户烙下深刻的印象,标签化也是硬伤。



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简介:百泰克(Bio Teke)是国内实力比较强大的生物试剂企业,拥有诸多发明专利、实用新型专利,产品覆盖面比较广。同时拥有强大的机电自动化设计团队,开发出诸多自动化仪器,比较有特色的有自动吸头装盒机,这样的仪器在国内的生产商屈指可数,在国外也不多见,笔者也只看到这家了。另外其96核酸提取仪也颇具特色。


核心产品:仪器、分子生物学产品。


点评:产品没有标签化,全面发展,有利有弊。



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简介:康为世纪创办之初基本上可以说是TIANGEN的原班人马,所以其产品线也大致相同,但是康为世纪也打出了自己的特色产品——蛋白提取相关试剂。这个帝都的公司在江苏开设工厂,可以说是其明智之举。一方面帝都常常受到各种节日会议的影响,物流比较难以应付;另一方面,帝都人工成本也随着房价水涨船高,不适合创业。康为世纪抓住低成本的特点,后发有力。


核心产品:蛋白提取、核酸系列。


点评:个人认为体量小于一亿的公司都可以把工厂迁出帝都了,有的成本不必要承受。T公司培养了那么多人才,也培养了很多竞争对手,算是试剂界的华大了。



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简介:博迈德(Biomed)以测序入手,并不断拓展产品线,现如今在分子生物学领域已经是一家产品门类齐全的试剂公司。在帝都,所有的生物公司都有其固定的客户群,博迈德也一样。在地方市场,博迈德的Marker系列,感受态细胞系列,也能夺得一席之地。


核心产品:测序、感受态细胞。


点评:产品容易做全,但客户却不容易全选。



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简介:美基(Magen)生物是一家专注于核酸分离纯化领域的公司,Magen提供的核酸纯化产品涉及所有的生物样品,并在样品高通量处理有着独特的优势。Magen公司提供了七大纯化技术,包括有硅胶柱纯化技术(HiPure),  磁珠法纯化技术(MagPure),  溶液型纯化技术(SolPure), DNA/RNA和蛋白质共提取技术(AllPure), 样品直接PCR技术(AmPure),生物样品DNA保护技术(DNASafer)以及生物样品RNA保护技术(RNASafer)。


核心产品:核算纯化系列产品。


点评:算是地方品牌的崛起,就是营销差了点。



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简介:艾德莱(Aidlab)的核心骨干在科研试剂领域沉淀多年,有着深厚的技术背景,不仅拥有自创的品牌艾德莱,还给国内外十几家公司提供技术配方转让,或者代工OEM生产。产品远销欧美和中东等国外市场。


核心产品:困难特殊样品如多糖多酚含量丰富植物、粪便、土壤等的核酸分离。

 

点评:都说搞不定的时候总是想到他,营销还是要正规化才能打出品牌。

 


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简介:索莱宝(Solarbio)也是一个大而全的生物试剂公司,在这个领域走大而全的路线也许是没有办法的事情,因为客户需求小散乱多杂繁。索莱宝就是凭借满足客户一切需要,以分装国外的试剂为起点发展起来,如今全线产品已经达到5000多种。


核心产品:生化试剂。


点评:大而全也能成为一种特色。


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简介:天恩泽(TIANDZ)生物由海归创办,掌握着一些独特的技术,特别是RAN酶固相清除剂深受客户好评。从产品的名字上可以看出,创始人有着一颗红红的中国心,也许是出门在外,太过于思念故土。DNA、RNA纯化取名叫做“天净沙”,回收系列取名为“归去来”。经过十多年的经营,天恩泽已经是全部产品线一个不落下,最近又新推出了质粒库。


核心产品:固相RNase清除剂。


点评:用不用这家的产品就看你是否愿意在文章末尾写古诗词。

 


 

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简介:唯地生物以前叫做第二实验室,凭借着过硬的感受

试剂 耗材 品牌
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无论是学霸学渣,你都应该了解这些品牌(一)
从本期开始,小编将邀请业内资深人士,不定期为大家简要介绍生物试剂、仪器的品牌,增进大家对各大品牌供应商的了解。事先声明:本订阅号介绍品牌纯属个人观点,如有雷同,纯属抄袭;如有不服,自行更正。QIAGEN &. TIANGEN简介:QIAGEN凯杰是德国...

从本期开始,小编将邀请业内资深人士,不定期为大家简要介绍生物试剂、仪器的品牌,增进大家对各大品牌供应商的了解。

事先声明:本订阅号介绍品牌纯属个人观点,如有雷同,纯属抄袭;如有不服,自行更正。


QIAGEN &. TIANGEN




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简介:QIAGEN凯杰是德国著名试剂公司,核酸纯化第一品牌。2005年成功收购北京TIANGEN,秉承严谨的传统,提供高质量的试剂盒。TIANGEN在其后的几年产品质量和品牌价值也得到极大的提升。

核心产品:核酸纯化系列;PCR/RT-PCR/qPCR;蛋白表达、纯化、检测。

点评:这是一家牛逼的企业,一直走核酸纯化精品路线,一路上狠心砍掉了不少非相关业务,但是核酸纯化企业何其多耶,除了天根还有一大批地根。



Thermo Fisher Scientific


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简介:如果你是90后,你可能不知道这十年发生在生命科学界的几次大收购,成就了今天的Thermo Fisher Scientific:2006年,美国热电集团与飞世尔科技合并形成Thermo Fisher;2008年,Invitrogen与Applied Biosystems合并形成Life Technologies;2014年,ThermoFisher 以136亿美元收购Life Technologies,成为今天的Thermo Fisher Scientific。包括你在文献中看到的Thermo Scientific、Fisher Scientific、Invitrogen、ABI、Gibco、Ambion、NUNC、Oxoid、Fermentas、Pierce。

核心产品:Thermo Scientific仪器设备;ABI仪器系列;Invitrogen分子生物学;Gibco细胞培养试剂;Ambion RNA提取;NUNC 细胞培养耗材系列;Oxoid微生物培养系列;Fermentas酶系列、Pierce蛋白研究系列。

点评:可以说Thermo Fisher Scientific是全宇宙最牛的生物试剂公司,不过也是最装的公司,常常把血清搞得一瓶难求。

 


MERCK

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简介:Merck是全球性的化学品公司,1998年收购Novagen,2010年收购Millipore;2014年,Merck以170亿美元收购Sigma-Aldrich,成为Thermo Fisher Scientific强劲的对手。Sigma-Aldrich最知名的生化试剂供应商,其产品几乎涉及所有领域,代表了最高品质。以后见到Novagen一定不要不认识。

核心产品:化工产品、各种生化试剂及标准品、抗体、纯化过滤。

点评:国外巨头都在并购,这是要干啥?


Corning

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简介:Corning(康宁)世界上最大的塑料制品公司之一,但塑料制品却并不是该公司最大的业务,Corning的玻璃产品也非常出名,大家一定听说过大猩猩玻璃。康宁已经成功收购AXYGEN。AXYGEN是知名的分子生物学耗材提供商,同时AXYGEN也提供核酸纯化试剂盒。

核心产品:细胞培养试剂耗材;分子生物学耗材;核酸纯化试剂盒

点评:康宁是一家价格比较亲民,质量过硬,以市场为导向的公司。



NEW ENGLAND BioLabs

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简介:NEB世界第一大工具酶生产商,可以提供200多种限制性内切酶和多种与DNA或蛋白修饰相关的重组酶。

核心产品:各种限制性内切酶修饰酶

点评:看名字就知道是这是一家很牛的公司,当然咯,牛的公司都喜欢装。


TAKARA



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简介:TAKARA是一个日本品牌,2005年成功收购Clontech。Clontech公司聚集了一大批优秀的科学家,在分子研究的各个领域开发出了许多设计思路独特,快捷便利的试剂产品,紧跟科学前沿。当然除了Clontech,TAKARA旗下还有很多优秀的品牌,比如cellartis、EXIQON、IBL。

核心产品:分子生物学试剂、酵母双杂交系统、RACE试剂盒

点评:TAKARA曾经是中国每个实验室必须,不过在品牌多元化的今天,谁也主不了沉浮了。

 


罗氏


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简介:罗氏应用科学部是生命科学研究领域内全球领先的试剂和系统供应商。拥有PCR以及地高辛标记产品的全球专利,其DIG标记产品和细胞凋亡相关产品在业内享有极高的声誉。

核心产品:原位杂交、地高辛标记检测。

点评:罗氏虽大,真正能够用到实验室的就那么几个产品。



Amresco


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简介:Amresco生产的生化试剂质量高,价格低廉,在分子生物学领域被广泛使用。

核心产品:琼脂糖系列,丙烯酰胺系列,缓冲液系列,表面活性剂系列,抗生素系列。

点评:大多数假货都说自己是Amresco,因为Amresco实在太难分辨了,真正的代理商也不知道是谁,不过上基因帮会告诉你。

 


GE生命科学

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简介:GE生命科学是多元化发展的美国通用集团下的一个部门,其蛋白纯化柱无可替代。当初杰克韦尔奇的观念就是一定要做行业数一数二,所以GE的产品在业内的地位很高。2014年,GE收购Thermo Fisher旗下的Hyclone,地球上两大血清品牌总算各自找到了归宿。Hyclone提供高等级的血清,其采用的滤过系统最大程度的去除了支原体等污染。

核心业务:蛋白纯化、细胞培养。


Santacruz



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简介:Santa cruz是美国也是世界上最大的抗体生产厂家,目前可提供的抗体品种多达四千多种,几乎覆盖了目前生命科学研究的各个最新领域。

核心业务:抗体、多肽、ELISA试剂盒

点评:2016年,美因动物福利对Santa Cruz公司开350万美元巨额罚单,说它虐待动物,不过好像没有对它造成多大的伤害。在生命科学研究领域,不虐待动物,就只有等着虐待人类了。


abcam

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简介:Abcam位于英国剑桥科学园,成立于1998年,著名的抗体生产厂家。

核心产品:蛋白、多肽、抗体、ELISA试剂盒

点评:由于价格昂贵,这个品牌是奸商最喜欢仿制的品牌之一。


RD


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简介:Bio-Techne公司是一个全球性的细胞生物学资源库,优质的蛋白质,抗体,ELISA试剂盒,实验室试剂,和科研工具供应商。旗下品牌包括R&D Systems、NOVUS、TOCRIS、ProteinSimple、BiosPacific、CLINIQA、ACD。

核心产品:蛋白、抗体、ELISA试剂盒

点评:RD也是假冒ELISA试剂盒最泛滥的品牌,树大招风。

品牌 试剂
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用什么试剂才能够支撑一篇牛文
这个话题,初入实验室的你一定很想知道。今天邀请到一位试剂耗材的销售人员,给大家分享一些心得,也许是其他试剂耗材推销员不愿意告诉你或者他自己也没有搞清楚过。来听听他怎么说。我去实验室跟研究生交流,谈到试剂耗材的时候,总有研究生会说:“我们这个实验很重要,我们打算...

这个话题,初入实验室的你一定很想知道。

今天邀请到一位试剂耗材的销售人员,给大家分享一些心得,也许是其他试剂耗材推销员不愿意告诉你或者他自己也没有搞清楚过。来听听他怎么说。

我去实验室跟研究生交流,谈到试剂耗材的时候,总有研究生会说:“我们这个实验很重要,我们打算至少发一篇5分以上SCI,必须用大牌试剂盒。”


看吧,童鞋们无意中已经把发表文章的分数绑架在试剂盒的品牌上。而试剂耗材厂家也顺着客户的意思,把用自己的产品发表过的优秀文章贴在最显眼的地方,并以此作为最大的卖点。

我只想说:文章的分数与试剂品牌没有半毛钱的关系。


事先声明,我们这里说的试剂不包括以假乱真的抗体、ELISA试剂盒,假货是没有资格谈文章的。我们这里说的试剂是比如核酸纯化试剂盒,PCR试剂盒之类,分了进口国产,高中低不同档次。


实际情况就是:并不是你用了比较大牌的产品,才能发表比较好的文章,而是因为你发表了比较好的文章,才衬托出了这个产品的价值。产品的品牌也才因此有了那么大的品牌效应,要不然商家为什么用它来往脸上贴金呢?


大多数发表过牛文的产品厂家,都是国外早期的试剂公司,而中国的试剂公司,还处于起步发展阶段,没有积累起很多大文章;同时,即便是有人用国产试剂发表了大文章,在崇洋媚外的心态作祟下,也不一定会把它写在文章中。这是我们行业的悲哀。

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大数据这个概念是近几年热起来的,而品牌的确是一个产品质量的大数据。前人的实验结果,使用经验,反复验证出质量过硬的产品,在庞大的数据支撑下才能打造出品牌。不容置疑,产品的质量和品牌效应是相关联的,但是从来不与文章关联。


你一定会豁然开朗:对啊,文章只与idea相关,不是吗?但是你却不自觉的认为试剂盒的品牌会托起你的文章的分量。多年的市场经验,我看到不少发表于Nature、Science、Cell的文章,DNA提取用的是手工的土方法,RNA提取用的是国内一个小作坊生产出来的。

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很多试剂耗材的推销员,推广一个小品牌,也非要拿文章数量跟大牌较高下,完全是鸡蛋撞石头。因为他们根本不明白,文章和试剂关联其实是个伪命题。国产的试剂要证明自己质量好,只需要老老实实的做出效果就行了。

作为消费者要明白,大牌产品价格昂贵,并不是成本高昂,这就跟衣服一样,同样的两块布,价格差距可能会很大。让你是否舍得出钱是你承受质量风险的能力决定的。用什么品牌的试剂并不决定你能发多少分的文章,用什么品牌的试剂也不是由文章分数决定的,而是你老板的经费决定的。


所以,年轻人,要想发好的文章,还是要着眼于研究思路上,多看大牛的文章,学习各种实验方法,听取师兄师姐的经验教诲。当然啦,你还可以关注基因帮科研服务,科研资讯、实验干货,试剂推荐,应有尽有~



试剂 耗材
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那些年,你看不懂的引物纯化
DNA合成纯化行业从来也没有标准,基本上都是各个公司自有一套纯化方式,(其实整个生物试剂行业都是这样,没有行业标准,所以才需要那么多试用装,用起来有效果就是好产品),这种行业的乱象,也让使用者头痛不已,所以今天给大家梳理一下DNA合成纯化方式,让那些看不懂的什...

DNA合成纯化行业从来也没有标准,基本上都是各个公司自有一套纯化方式,(其实整个生物试剂行业都是这样,没有行业标准,所以才需要那么多试用装,用起来有效果就是好产品),这种行业的乱象,也让使用者头痛不已,所以今天给大家梳理一下DNA合成纯化方式,让那些看不懂的什么鬼都见鬼去吧。


少废话,直接讲。0


从DNA的化学合成原理可知,DNA的化学合成是从3'端开始,经一系列的化学反应,逐个地将碱基连接起来的。碱基偶联反应的效率可达到99%,也就是说,每附加一个新碱基,都会有总量的1%的DNA片段附加不上新的碱基(出现合成失败DNA片段),如果初始合成序列是1,当合成N个碱基的时候(做了N次反应),就剩下0.99的N次方条序列了,如果合成20个碱基,大概就剩下81.7%的完整序列,其他的都是不完整的碱基片段,而这些合成失败的DNA片段全部残留在合成DNA粗制品中。如果使用此粗制品直接进行PCR、测序反应时,会影响实验结果。如果进一步考虑其他因素,失败DNA的比例还会进一步增大。因此,对合成DNA粗制品进行纯化是非常重要的。下面就来说说目前市面上的几种纯化方式。


C18柱脱盐

将寡核苷酸通过C18柱,该柱对DNA有特异性吸附,可被有机溶液洗脱,但不会被水洗脱。因此能有效地去除盐分,但不能有效去除比目的片段短的小片段。该方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。脱盐,顾名思义去除DNA样品中的盐分,但不能去除错误序列 


OPC 纯化

OPC(Oligonucleotide Purification Cartridge)是使用一种叫 Cartridge 的反相层析柱(美国 Waters 公司生产 ) ,根据 DNA 保护基( DMTr 基)和 Cartridge 柱中树脂间的亲合作用的原理进行目的 DNA 片段的纯化。DNA 合成是用全自动 DNA 合成仪从 3‘ → 5‘ 进行人工合成的。在刚合成完的 DNA 的 5‘ 端的碱基上带有一个 大型的疏水性保护基团 DMTr 基,而中间产物的短链杂质 DNA 中不具有 DMTr 基。利用这一性质进行目的 DNA 的纯化,可将合成失败的不完整的DNA片段去除。

HAP纯化

HAP(High Affinity Purification)是生工生物自主开发的新型oligoDNA纯化方法。其原理是利用合成引物5'-端DMT基团对HAP树脂专一性吸附,而不含DMT的短链DNA不被吸附,从而达到分离纯化的目的。制品纯度可达到80~90%,可以满足杂交探针、测序、常规PCR(不再做进一步克隆实验)等用途了。但是因为其专一性吸附 DMT 能力有限,不免仍然有短片段带入的可能,而且负载量小。特别是对长于39 碱基以上的片段纯化效果不好。此方法只提供长度在10-39mer以下的合成oligo DNA制品序列更长时,制品的纯度得不到保证。


 TON纯化

基于特异和反相层析法,从合成好的产物中去除失败序列,提供最终的目标序列。适于35个碱基以下的引物。毛细管电泳(Capillary Electrophoresis)纯度大于75%。


PAGE纯化

PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis),该方法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化基于尺寸和构象分离全长产物和失败序列,可以分离相差一个碱基的引物(120碱基以内),从而提供高纯度的引物。纯化后的DNA纯度大于90%,相比与其他纯化方法,PAGE纯化对长链Oligo DNA (大于50 mer)的纯化特别有效,制品纯度保证90 ~ 95%。如订购的DNA欲用作RT-PCR引物、各种探针,或用于PCR克隆测序、定点突变等,请选用PAGE纯化制品。


ULTRA PAGE纯化

理论上分析型PAGE变性电泳,可以区分引物之间一个碱基的差别。经过PAGE纯化的引物,特别是长引物要的量都比较高,上样量都是非常大,电泳时的条带往往比较宽,带与带之间有重叠,分辨率有所下降,电泳后割带回收目的引物时,导致割的条带有时可能比较宽,很难避免割到差别仅一个或几个碱基的引物。因此生工生物为了给客户更好解决以上问题,将原有的PAGE纯化方式升级优化为现在的ULTRA PAGE纯化方式,即在PAGE纯化的同时配合质谱对DNA进行定性分析,以保证回收片段的正确性。当然,市场的竞争会促使其他公司也对PAGE纯化进行升级,华大基因也将PAGE升级为PAGEplus,什么意思你们自己去理解。


RPC纯化

RPC是通过反相净化滤芯 (Reverse Phase Cartridge) 对引物进行纯化,纯化原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较,RPC是一种有效且更加经济的纯化方式。反相净化滤芯通常包含一种疏水基质如 C18的硅胶,能够很好的吸附DNA,并且可以用水轻松地将切割下来的保护基团和短的引物片段从反相柱上洗掉。RPC纯化的引物可以应用于DNA测序、 PCR及基因合成等。


HPLC纯化

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)是使用高效液相色谱的原理,依据DNA的疏水性来分离产物的。合成粗产物中不同长度的 DNA 片段的疏水性不同,一般来说较长的片段具有较强的疏水性,AT含量高的片段也具有较强的疏水性。先将粗产物检测主峰位置,再增加加样量,回收主峰位置的部分。该方法用于分离纯化时能达到很高的纯度和灵敏度,可以有效的去除大部分N-短片段,因而可以除去失败序列或未结合的标记物,从而对DNA片段进行纯化。同时配合质谱对DNA进行定性分析,以保证回收片段的正确性。由于HPLC产品的纯度非常高,使用本法纯化的DNA制品可适用于各种基因工程实验。


不管各大公司如何升级纯化方式,目前都可以列入三个纯度级别中,详情见下表:

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这个表格可以让大家更方便的选择纯化方式,特别是大规模合成引物的情况下,可以节省很多经费。举个例子,如果合成30个碱基以下,就没有必要用PAGE了,因为这个片段范围PAGE无法发挥其优势,即便你选择用PAGE,商家给你OPC级,也是没有差别的,不过这里说的是无良商家,生物行业大多数商家还是很诚信的。再比如在同一个纯度级别下,商家改变名称变相加价,这也是大家需要谨慎选择的,不过土豪就随意了。


引物纯化
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教育经历

2007.06毕业 西南大学 / 本科 专业:生物工程

工作经历

2007.08——2009.09 成都博瑞克生物技术有限公司

职位名称:销售工程师

工作简介:生物试剂销售工程师

2012.05——2013.01 上海英维捷基生物技术有限公司

职位名称:大区经理

工作简介:管理大区工作人员,为用户做售前咨询和售后服务,包括且不限于:设计实验方案、设计引物,调试荧光定量实验等等。

张伦
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